ＤＮＡ確認実験

１．高校での生徒実験

　(1)ＤＮＡ分解酵素による確認
　　　アベリーの実験を生物ＩＢで教えるせいか、ＤＮＡ分解酵素による確認実験を連想する方が多いので、やってみました。

－使用した酵素－
　プロティナーゼＫ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ　Ｉ
－方法－
　　１．抽出したＤＮＡを、４０ｍｌの水に溶かす。
　　２．４本の試験管に分注する。
　　３．それぞれに、プロティナーゼＫ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ　Ｉ、水を入れる。
　　４．３７度で５分反応させた後に冷エタノールを入れる。
　　５．ＤＮａｓｅを入れたものだけが白く濁り、繊維状の沈殿が見られなくなった。

左から　プロティナーゼＫ　ＲＮａｓｅ　　ＤＮａｓｅ　Ｉ　水

＊ＲＮａｓｅでもほとんど変化が見られないことから、得られた物質にＲＮＡはそれほど多くは入っていないと考えられる。

(2)染色による確認実験
　酢酸オルセイン、ギムザ液、メチルグリーンなどの細胞核を染色する色素による染色で確認する。
　　１．抽出したＤＮＡを少量の水に溶かす（抽出したものを１ｍｌ程度の水に溶かす）。
　　　　※ＤＮＡを一度濾紙の上に乗せ、エタノールをよく取り除く。ただし、完全乾燥させると、水に溶けにくくなる　　　　ので、少し湿った状態ぐらいが望ましい。
　　　　※なるべく濃い溶液を作った方がうまく行く。
　　２．キャピラリーを用いて、ろ紙にブロットする（ペーパークロマトグラフィーを使った光合成色素の分離の時と同様に。１回で充分）。
　　３．よく乾かす。
　　４．細胞核を染色する色素に５分程度浸して染色する（著者は酢酸オルセイン、酢酸カーミン、ギムザ液、メチ　　　　ルグリーン、メチレンブルーで試して全てうまくいった。写真は酢酸カーミン）。
　　５．熱湯で洗って脱色する。
　　６．ブロットしたところが、染めあがっている。
　この方法の場合は、生徒が実際に細胞の核を染色した色素で染めているので、直感的に理解しやすい。
　

　　　↑　　　　　　　　↑　　　　　　　　　↑
　　ＤＮＡ　　タンパク質（ゼラチン）　ＤＮＡで「ＤＮＡ」と書いてみました(^_^)　

　タンパク質では全く染色されませんが、ＤＮＡでは良く染まっています。

２．研究室レベル
　(1)吸収スペクトル
　　　前述した抽出法で抽出したＤＮＡの吸収スペクトルをとったところ、左図のようになった。
　　　２６０／２８０＝１．８４

　(2)アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドによる染色、紫外線をあてて撮影
　　　右図のように、スメア状に広がった。様々な分子量のものがあることを示している。
　　　抽出の途中で、様々に切れたことを示している。

(3)メチルグリーンと混合後、アガロースゲル電気泳動

１％メチルグリーン１μｌ＋グリセリン１μｌ＋ＤＮＡ１３μｌ
を混合してゲルにのせた後、電気泳動したもの

１　制限酵素によって抽出したＤＮＡを分解した物（量が多い）
２　制限酵素によって抽出したＤＮＡを分解した物（量が少ない）
３　ＤＮａｓｅによって抽出したＤＮＡを分解した物（量が多い）
４　ＤＮａｓｅによって抽出したＤＮＡを分解した物（量が少ない）
５　抽出したＤＮＡをそのまま（量が多い）
６　抽出したＤＮＡをそのまま（量が少ない）

エチジウムブロマイドは高校では怖くて使えないので、メチルグリーンを代わりに使ってみました。
最初は、エチブロ同様に染色後脱色してみたのですが、時間がかかるので、最初から混ぜました。
現時点ではあまり意味はないと思うのですが、もう少し工夫すれば使える気がします。
ＰＣＲ産物でもできるかと思って確かめてみましたが、残念ながら感度が悪いので検出できませんでした。

(4)ＰＣＲ
　抽出したニワトリのＤＮＡをtemplateにして、ＰＣＲをやってみました。
　アクチン（house keeping geneとして選びました）の遺伝子の一部を増幅させました。
　下図のＭはマーカー（一番下は１００ｂｐ）、①～③はバンドがでることが確実なtemplateのもの（posi con）、④と⑤が抽出したＤＮＡをtemplateにしたものです。
　少し、量が多すぎて、templateそのものが写ってしまっていますが、はっきりとアクチン遺伝子が増幅されているのがわかります。
　従って、この方法で抽出したＤＮＡでもＰＣＲができますね。
　ただし、もともとＰＣＲは極微量のＤＮＡでもできるので、確認実験というわけにはいきません。
　発展実験というところでしょうか。

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