ＤＮＡ抽出実験
| この方法は、埼玉大学理学部生体制御学科細胞学教室 坂井貴文教授との共同開発です。 |
実験法
Ⅰ．準備
１．材料
凍らせた鳥のレバー
ブロッコリーでも可。芽の部分を使って下さい。
２．薬品・器具
２mol/l食塩水、エタノール（９５％以上）、氷
ミキサーあるいはフードプロセッサー（あるいは、おろし金、乳鉢・乳棒）、ガーゼ、ビーカー、ろ紙、漏斗、薬さじ、ミニ薬さじ、ガスバーナー、三脚、金網、試験管ばさみ
Ⅱ．実験手順
１．凍らしたトリのレバー約５０ｇ（１羽分）、洗剤液（台所用中性洗剤を１押ししたもの）２００ｍｌをミキサーに入れ、２分間連続運転で粉砕する。
（ブロッコリーの場合はフードプロセッサーを使用した方がうまくいく。その場合は、凍らせたブロッコリーの芽の部分（多少茎が入っても大丈夫）２００ｇに洗剤無しの水だけを２００ｍｌ（うまくフードプロセッサーが回らなかったらもう少し）を加えて５分間連続運転で粉砕する。液体と言うよりもペースト状になる。）
ミキサーがない場合は、次の方法でもできる。
.凍らせた鳥のレバーをおろし金でおろす（１匹分（５０ｇ程度）の半分ぐらいをおろす）。
.洗剤液を１０～１５ｍl加えて、乳鉢・乳棒を使ってよくすりつぶす。
２．各班に３０ｍｌ程度ずつ配る。（あとで食塩水を加えるので１００mlのビーカーがちょうど良い）
３.食塩水を等量（それまでの全量に対して）加えて、軽く混ぜる。
食塩水を加えると急に粘性があがる（食塩水の終濃度が１～２ｍｏｌ／Ｌの間に収まるようにする）。もし、このときにどろっとした状態にならなかった場合は、やり直した方が無難である。
（ブロッコリーの場合は、水分が多いので、食塩を直接加えて終濃度が１～２ｍｏｌ／Ｌの間になるようにする。ブロッコリーの場合は粘性はあまり変わらない。）
食塩は、タンパク質とＤＮＡの結合を切ると考えられている。
| ここまでの過程では、ＤＮａｓｅのはたらきにより、ＤＮＡが壊されていく。手早く行うこと。目安としては、５分程度。 湯煎の準備をしてから、実験を始めないとうまく行かない。 |
４.ビーカーに移した後、１００℃で５分湯煎する。
タンパク質が凝固し、レバーの色が赤色から白色に変化する
まで加熱する。
この時、ＤＮＡは壊れやすい状態である。優しく扱うこと。
５.手で触れるようになったら、四枚重ねのガーゼ（あるいはさらし１枚）で濾過する。
この段階では、ＤＮＡの粘性が高すぎて、ろ紙では濾過しにくい。そこでガーゼでろ過する。
３０ml程度絞る。固形物がガーゼを通り抜けることもあるが、あまり気にしなくてもよい。あまりにも固形物が出るようなら２０mlぐらいで止めても良い。しかし、少なすぎると収量が少なくなって、あとで消えてしまうので要注意。
６.ろ液を良く冷やして、冷エタノールを静かに入れ、ミニ薬さじを逆さにして、静かにかき混ぜる。
エタノールは予め氷冷しておく。
加える量は、溶液の２～３倍体積。入れすぎても全く問題ない。
ＤＮＡは繊維状になるのでガラス棒に巻き付いてくる。こ
の段階では多くの不純物が含まれている。
すべて巻き取った後、もう一度かき混ぜてみること。塩溶液とエタノールが接触していないと沈殿しないので、そこの方にまだ溶けたままのＤＮＡが残っていることが多い。
ＤＮＡはエタノールには溶けないので、エタノールを入れると沈殿する。温度が低い方がより溶解度が下がるので、温度をできるだけ下げて沈殿させる。
７.巻き取ったものを別のビーカーに入れ、食塩水を２０～３０ｍl程度加えてよく溶かす。
このときも、不純物の混入はあまり気にせずに収量を多くするようにする。
巻き取ったときについてきたエタノールはなるべく取り除く。エタノールが残っていると、食塩水に溶けないので、最後に消えてしまうことになる。
よく溶かす
８.再び湯煎する（３分間）。
湯煎しながらかき混ぜるのだが、優しくかき混ぜること。長く湯煎するとＤＮＡが壊れてしまうので、時間を計ること。
９.濾過する
熱いうちにろ過した方が粘性が低いので濾過しやすい。
１０.ろ液を良く冷やしてから、冷エタノールを静かに入れ、ガラス棒で静かにかき混ぜる。
濾過しながら冷やすと良い。
加えるエタノールは、塩溶液の２～３倍体積。入れすぎても問題ない
ろ液とエタノールの境界面に白い雲のような沈殿が見えるはずである。ゆっくりとかき混ぜると、透明から白色のＤＮＡが巻き付いてくる。
量が少ない場合は、できるだけ静かにエタノールを注いで、しばらくそのまま待ってみる。
ビーカーを静かにゆらして境界線に注目してみると、少量のＤＮＡができている場合がある。
揺らしながら混ぜていくと沈殿が増えることもある。
このような場合に最初からかき混ぜてしまうと、見失ってしまうことがある。
エタノール沈殿させるとエタノールには解けない気体が気泡となって出てくる。
かき混ぜないで、そのまま放置しておくと、気泡によって上昇してくる。
Ⅲ．失敗したときの注意点
原因１.収量が少なすぎる
失敗の最大の原因はＤＮＡが途中で無くなってしまうことである。純度よりも収量を多くすることを常に念頭に置いて実験すると良い。
(1)最初にすりつぶすレバーを多くする。
(2)実験手順２で、しっかりすりつぶす。（しかし、時間をかけてはいけない。２分程度で）
(3)実験手順４で、しっかり搾る
(4)実験手順７でできる限り巻き取る
(5)ブロッコリーの場合は、すりつぶす段階から、食塩を加えるところまでなるべく濃いブロッコリーになるように努力する。
原因２.温度が高すぎる
エタノールによるＤＮＡの沈殿は温度が高いとうまくいかないので、ＤＮＡ溶液もエタノールも良く冷やしておく。
原因３. 食塩水濃度が下がりすぎる
１～２mol/lの食塩水がＤＮＡを良く溶かすので食塩水の終濃度が１mol/ｌより下がらないようにする。
特に、２mol/lの食塩水を調製するときに、計算を間違えないように（１ｌに１２０ｇの食塩です）
原因４ 最後のエタノール沈殿の時に、エタノールを手荒に入れてしまったか、あるいは手荒にかき混ぜてしまう。
２回目のエタノール沈殿の際は、できるだけ静かに行う。
原因５ １回目のエタノール沈殿の後、再び食塩水に溶かすときに、エタノールがたくさん残ったまま溶かそうとした。
エタノールが残っているとうまく溶けないので、ろ過したときに濾紙に残ってしまう。なるべくエタノールを取り除いて食塩水に良く溶かすこと。
原因６ 最初にすりつぶすときに時間をかけすぎる。
加熱するまではＤＮＡ分解酵素が働くので時間をかけすぎると分解されてしまう。
２分程度、長くても５分以内にすること。
原因７ ２回目の湯煎を長くやりすぎてしまう。５分以上行うと失敗する班が出てくる。
実践効果
実験開発の目的
この実験法の特徴
Ⅰ．今までのＤＮＡ抽出実験法には、以下のような大きな問題があった。
１．１時間の授業時間内に収まらない。
２．クロロホルムなどの危険な有機溶剤を使 う。
３．遠心分離器という高度な機材を使う。
４．精巣やカイコの絹糸腺などの特殊な材料 を使う。
Ⅱ．本実験法では、これらの問題を全て解消し、手軽にＤＮＡ抽出実験を行えるようにした。
１．遠心分離器を使わない
２．クロロホルムを使わない
タンパク質を除去するためにクロロホルムを使用する方法もあるが、このような有機溶剤はできれば生徒に使わせたくないものである。
３．材料には鳥のレバーを使用する。