アベリーの行った実験

　遺伝子の本体はＤＮＡである。このことを最初に示したのはアベリーである。高校の教科書にも必ず登場するアベリーの実験であるが、グリフィスの形質転換の実験と一緒になって、アベリーがネズミの体内での形質転換実験をしたかのように紹介されている例も少なくない。そこで、アベリーの行った実験をなるべく正確に紹介することにした。

時代背景
　この時代の一般的な常識として、遺伝子はおそらくタンパク質であろうと考えられていた。
　遺伝子は、生物の膨大な多様性を特徴づけるために、一つの物質でありながら無限と言えるほどの多様性を要求される。
　当時、タンパク質がこの要求にこたえられることが既に知られており、また、逆にタンパク質以外にその要求にこたえられるものが知られていなかった。
　ＤＮＡは既にその存在が１８６９年ミーシャーによって示されていたが、その構造については、１９０９年に唱えられたテトラヌクレオチド説で説明されていた。
　テトラヌクレオチド説というのは、ＤＮＡはアデニン・グアニン・シトシン・チミンの４つのヌクレオチドが組になって同じ順番でつながっているものだというものである。この説に従えば、ＤＮＡは単純な分子であり、多様性などを持ちようがなかった。今で言えば、デンプンといったような物質に例えられる。
　「遺伝子はデンプンである」という主張をしても相手にされない。デンプンのことを「知っている」人であれば、デンプンが多様性を持ちようがないことを知っているので、不可能だと考えるからである。
　このような時代に、遺伝子がＤＮＡであるということを主張すれば、当然多くの批判を受けることになる。
　このため、アベリーの論文はずいぶん慎重に書かれており、論文発表後に当然出てくるだろう反論に予め備えているような印象を受ける。例えば、この論文の中では「ＤＮＡは遺伝子である」ということは一度も書かれておらず、「ＤＮＡは形質転換物質である」と述べられているに過ぎない。


実験の内容
１．形質転換物質の抽出
(1)Ｓ型の肺炎双球菌を５０−７０リットルの牛心臓スープ中で、３７℃、１６−１８時間培養。
(2)肺炎双球菌を遠心して集め、約１５０ｍｌの生理食塩水に懸濁。
(3)６５℃に急速に温度を上げ、３０分間保温。
(4)生理食塩水での洗浄を３回。
(5)終濃度０．５％デオキシコート酸塩を加え、３０−６０分振とうして抽出
(6)遠心分離して再び細胞を集め、もう一度(5)の操作を繰り返す（これを合計２−３回）
(7)無色透明なデオキシコート酸塩抽出物に３−４倍体積の純エタノールを加える。
(8)沈殿を約５０ｍｌの生理食塩水に再び溶かす。
(9)クロロホルムを加えてタンパク質を除去する。（これを２−３回繰り返す）
(10)再び、エタノールを３−４倍体積加える。
(11)沈殿を莢膜多糖類を分解する酵素を添加した１５０ｍｌの生理食塩水に懸濁後、４−６時間３７℃に保温。
(12)再び、エタノールを３−４倍体積加える。
(13)沈殿を約５０ｍｌの生理食塩水に再び溶かす。
(14)クロロホルムを加えてタンパク質を除去する。（これをクロロホルムと水層の境界にタンパク質のゲルが見えなくなるまで繰り返す）
(15)溶液をかき混ぜながら、純エタノールを０．８−１．０倍体積加える。
(16)攪拌棒の回りに付いてきた沈殿を生理食塩水・エタノールの５０％混合液で洗う。
(17)後の溶液に３−４倍体積のエタノールを加え、沈殿したものを生理食塩水に溶かし、(15)-(16)の操作を行う。（これを再三繰り返す）

２．培養
(1)培地として次の栄養スープに血清あるいは漿液を加えたものを使用
　栄養スープ……１％ネオペプトンに牛の心臓を入れたスープをｐＨ７．６−７．８に調製し、サルファー剤阻害を活性炭による吸着で取り除いたもの
　漿液と血清……１０％滅菌ヒト腹水あるいは胸膜液（抗Ｒ抗体を含む）

(2)培地に、継代維持されているＲ型肺炎双球菌と調べたい物質（抽出物や精製したＤＮＡなど）を加えて試験管で培養した。
　※加えた漿液などには抗Ｒ抗体が含まれており、培養しているときに、Ｒ型肺炎双球菌は凝集して試験管の底に沈殿して、上清は透明である。しかし、形質転換がおこってＳ型が生じてくると、この抗体では凝集しないので、上清が不透明となり、形質転換の有無を簡単に調べることができたようだ。もちろんアベリーは形質転換の事実をきちんと細菌学的な手法で同定しているが、日常的な判定方法として、このようにぱっと見ただけで判定できるのは大変便利であったと思う。

３．精製した形質転換物質の分析
(1)定性的化学テスト
・ビューレット反応（タンパク質検出）、ミロン反応（タンパク質検出）に陰性
・ディッシュのジフェニルアミン反応（ＤＮＡ検出）に強く陽性
・オルシノールテスト（ＲＮＡ検出）に弱く陽性（ＤＮＡにも弱く陽性）
・脂肪については特異的なテストがない。しかし、エタノール沈殿・クロロホルム処理によって形質転換活性が落ちなかった。

(2)元素化学分析
　窒素、リン、炭素、水素の含有分析を行った。

Ｎ／Ｐ比は１．５８−１．７５で、平均は、１．６７であった。これは、理論値（テトラヌクレオチド）の１．６９に非常に近いものであった。これが純物質であるという保障はないが、少なくとも、タンパク質などが混入していれば、この比率は変化しているはずである。

(3)酵素的分析
・結晶化したトリプシン、キモトリプシン、リボヌクレアーゼで処理したが、形質転換活性には影響がなかった。従って、形質転換物質はリボ核酸やトリプシンで影響を受けるタンパク質ではないことを示している。ペプシンはその低い最適ｐＨのためにテストしなかった。形質転換物質は低いｐＨで急速にその活性を失うからである。
・　また、種々の血清や組織抽出物の酵素もテストした。

この結果から、デオキシリボ核酸脱重合酵素と形質転換の不活性化が一致している。
※こんなまどろっこしいことをしているのは、純粋なＤＮａｓｅが無かったからである。当時、ＤＮＡは重要な物質とは考えられていなかったので、ＤＮａｓｅが商品とはならなかったのであろう。

・非感作イヌとウサギの血清の形質転換破壊作用の温度による不活性化について実験した
さらに、ニシンの精巣から精製したＤＮＡを使って、イヌとウサギの血清のＤＮＡ脱重合酵素活性と温度の関係を実験した。
　形質転換活性と温度

　ＤＮＡ脱重合酵素活性と温度


このように、形質転換活性を破壊する温度と、デポリメラーゼを不活性化する温度との間には著しい類似性がある。
　これが血清酵素の一般的な性質でないことは同じ血清のエステラーゼの温度不活性化によって示される。この場合は、逆にイヌ血清の場合は、６０℃でほとんど影響なかったのに対して、ウサギ血清では６０℃でほぼ完全に失活した。
　また、種々の物質で、形質転換活性を破壊する酵素の阻害能力をテストしたら、フッ化ナトリウムだけが有意な阻害能力を示した。そして、デオキシリボ核酸の分解もフッ化ナトリウムによって阻害される。
　※これも、純粋なＤＮａｓｅが無いので、なんとかＤＮＡ分解酵素と、形質転換活性が無くなることの関連を示そうと苦労している様子がうかがえる。

(4)血清学的分析
　精製した形質転換物質は、高い力価の抗タイプIII肺炎双球菌血清を作用させても、痕跡的な沈殿しか生じない。これは、肺炎双球菌のタンパク質は１：５０，０００に、莢膜の多糖類は１：５，０００，０００に希釈しても検出可能であることと著しく対照的である。
　※形質転換物質は、血清学的に見ても、タンパク質や多糖類ではないことを言いたいのであろう。

(5)物理化学的研究
　精製した形質転換物質を分析的超遠心分離機で調べた。その結果、形質転換物質はシャープな一つのバンドを示した。これは、形質転換物質が少なくともいろいろなサイズの物質ではないことを示している。分子量はまだわからないが、沈降係数が非常によく一致する胸腺核酸から推定すると分子量は５００，０００のオーダーである。
　電気泳動を行った結果、核酸に匹敵する比較的高い流動性の電気泳動要素だけが示された。形質転換活性は光学的に見られるバンドの速く動く要素と一致している。
　超遠心と電気泳動での精製した形質転換物質の挙動は核酸と一致している。
　紫外部の吸収曲線は２６００オングストロームの領域で極大を示し、２３５０オングストロームの領域で極小を示した。これらは核酸の特徴を示している。

(6)生物学的活性の量的決定
　高く精製した状態で、形質転換物質は０．０２から０．００３マイクログラムの範囲で形質転換を導入しうる。

１ｃｃに０．５ｍｇ含んでいる溶液は手順に示したように漸次希釈した。これらの希釈液のそれぞれ０．２ｃｃを２．０ｃｃの標準血清液を含む４組の試験管にくわえた。全ての試験管を０．０５ｃｃの５−８時間血液培養したR36Aの１０−４希釈液とともにインキュベートした。
　このデータは、２．２５ｍｌの体積の反応系に、乾燥重量０．００３マイクログラムの活性物質（１：６００，０００，０００）が形質転換を引き起こしうることを示している。

考察−省略−

結論
提示した証拠は、デオキシリボタイプの核酸が肺炎双球菌タイプ�V形質転換因子の基本的な単位であるという信念を支持している。


　アベリーは、ネズミの体内で形質転換させるような実験をしていたわけではない。
　また、非常に残念なことに、彼は、タンパク質が形質転換を起こしうるかどうかという点に言及していない。
「形質転換を起こしうる成分を抽出したら、それはＤＮＡらしい」と述べているに過ぎない。これでは明らかに片手落ちである。当時の常識である「遺伝子はタンパク質」という考えに反旗をひるがえすのであれば、肺炎双球菌のタンパク質を抽出して、その抽出物が形質転換を起こさないことを示すべきであったと思う。そうすれば、後日でてくる「不純物として含まれるタンパク質が作用しているのかも知れないではないか」という批判もなかったに違いない。
　高校の教科書では、このアベリーの実験と称して、似てもにつかない実験が紹介されている（アベリーがネズミの体内での形質転換実験をしたことになっているし、また、タンパク質で形質転換が起きないことを示したことになっている）。生徒の理解を助ける方便としても、あまりにもかけ離れているので、私は、「アベリー」の名前を出すべきではないと考えている。
　



これから、もう少し、私の意見、解説などを加えていく予定です。
とりあえずここまでのせておきます。

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